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    DB51 T 613-2006 柑桔黄龙病检验鉴定技术规程

  • 上传人: lu****yz
  • 文档编号:31978
  • 上传时间:2016-07-29
  • 文档格式:PDF
  • 文档页数:10
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    DB51 613 2006 柑桔 黄龙 检验 鉴定 技术规程
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    1、 案号: 6132006柑桔黄龙病检验鉴定技术规程 006布 2006施四川省质量技术监督局发布203 6132006 I 目 次 1 范围 . 205 2 规范性引用文件 . . 205 3 术语和定义 . . 205 4 原理 . 205 5 田间调查 . . 205 6 样品采集 . . 205 7 柑桔黄龙病菌分子鉴定(. 206 8 结果判定 . . 208 9 检测后样品的处理 . 208 附录 A (资料性附录) 柑桔黄龙病症状特征 . 209 附录 B (资料性附录) 柑桔木虱形态特征 . 210 6132006 204 前 言 本标准的附录本标准由四川省农业厅提出并归口。 本。

    2、标准由四川省农业厅植物检疫站负责起草,重庆大学参加起草。 本标准主要起草人:赵兰鸰、宁红、王中康、陈素清、李刚、帅波、夏雨先、袁青。 6132006 205柑桔黄龙病检验鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了柑桔黄龙病的田间症状调查、实验室分子检验技术要求。 本标准适用于对芸香科植物感染柑桔黄龙病植株以及柑桔黄龙病菌传播媒介的检验、检测和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最。

    3、新版本适用于本标准。 040柑桔苗木产地检疫规程 447柑桔溃疡病检验鉴定标准 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 桔黄龙病 由 起、主要由柑桔木虱 播的一种危害柑桔属、金柑属和枳属植物叶片、枝条和果实的检疫性病害。 4 原理 柑桔黄龙病的田间症状复杂多样,该病菌属难培养菌,目前尚无法进行人工培养,因此,在鉴定时除了进行田间识别外,主要采取病原菌增的方式进行检测。用根据柑桔黄龙病菌核糖体基因序列设计的一对特异性引物与模板待检样品中病原菌行聚合酶链式反应(引物与模板使样品所带的微量柑桔黄龙病菌终通过凝胶电泳分离检测出382根据该谱带的有无确定样品是否带有柑桔黄龙病菌。 5 田间调查 状调。

    4、查 用目测方法检查叶片、果实、枝条,症状特征参见附录 A。发现疑似症状样本送实验室检验。 桔木虱调查 4月9月检查柑桔植株的新芽、嫩梢上有无柑桔木虱,柑桔木虱形态特征参见附录B。发现柑桔木虱将其送实验室检测是否带柑桔黄龙病菌。 6 样品采集 桔叶片采集 定取样 6132006 206 采有典型和疑似症状的嫩梢叶片,样品装入牛皮纸袋中, 5天内送实验室检验, 取样数量按照 447测取样 采取五点取样法,采摘嫩梢叶片,每株分东南西北四个方位采集,样品装入牛皮纸袋中,5天内送实验室检验,取样数量按照 447桔木虱采集 用捕虫网在柑桔园内柑桔植株嫩梢上捕捉柑桔木虱,将木虱放入95酒精中密闭保存,送实验。

    5、室检验。 7 柑桔黄龙病菌分子鉴定(剂 除非另有说明,本标准所用试剂均为分析纯,所有试剂均用高压灭菌的无菌容器分装。 菌超纯水 O 冲液10 异性引物对50M 5 55/L NA 00 100异丙醇溶液 1M 剂,加水搅拌溶解,配好后高压灭菌。 1M 称取 37 剂,在磁力搅拌器上剧烈搅拌,边搅拌边加入 N 至 热溶解, 直到溶液澄清,高压灭菌。 10% 称取20末,加热到 68助溶。 取液 取T 10 4010 加热搅拌至 70混合均匀, 调 压灭菌,室温保存。 白酶 K 液10 g/L 称取 5白酶 K, 加入 500 L 无菌超纯水水混合均匀,存。 硫氰酸胍液4M 硫氰酸胍溶于 20 ,。

    6、62加热助溶,4保存。 泳缓冲液 1L 水中加入 42g,冰醋酸 H 2O,置成 50 倍贮存液;使用时稀释为 1 倍工作液。 脂糖凝胶2% 在%琼脂糖,融化后在每 100脂糖中加入 5V),冷却至 60倒入相应制胶槽中,插入梳子,冷却凝固。 器和用品用具 水平电泳仪 高速台式离心机,离心力可达10 000凝胶成像系统 微量移液器一套:0L,5L20L,20L200L,200L1000L 样制备 品存放 6132006 207采集的样品在28条件下保存应不超过一周,若需长期保存,应置于下,冻融不超过3次。 品预处理 片 随机的选取柑桔叶片,流水清洗干净,吸水纸擦干,于培养皿内用无菌剪刀将材料剪。

    7、碎,桔木虱 将采集的柑桔木虱1头5头,研磨棒将其磨碎。 品 取 在装有样品的离心管中加入800 合均匀后置于65水浴1h。 吸取上清液转入新的1.5 入 上清液1/2体积的异硫氰酸胍液,混合均匀,室温下放置10 0 000吸取上清液加入微滤柱中,10 000滤液。 向微滤柱中加入100异丙醇500 L,10 000滤液。 重复上一步骤,至滤液无植物色素。 空微滤柱10 000向微滤柱中加入50 0 000集滤液,即为样品模板测 测体系 柑桔黄龙病 测体系见表 1,体系总体积 25L/管。 表 1 柑桔黄龙病 测体系 检测试剂 终浓度 每管加入量 L 冲液 1 物对 .3 1U/25L 1 板0。

    8、5025L 2 总体积 25 应 依次将物对、入42 入循环,9220s,5630s,7245s,30个循环;727 下保存。 检测时同时设阴性对照和阳性对照。 泳及成像 泳 将物8L 与样品缓冲液混合,加入琼脂糖凝胶的点样孔中,同时设00 伏电压电泳约半小时。 6132006 208 像及分析 将电泳后的琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统观察窗内,观察分析并成像保存。 8 结果判定 田间症状作为一种辅助诊断手段。样品增产物经凝胶成像系统观察,凝胶上阳性对照出现一条382性对照没有该特异性条带;供试样品出现与阳性对照相同大小的382品为阳性,即带柑桔黄龙病菌;供试样品未出现与阳性对照相同大小的382品。

    9、为阴性,即不带柑桔黄龙病菌。 9 检测后样品的处理 用于柑桔黄龙病检测的样品、用具在完成检验后,用具应进行灭活处理,样品集中销毁。 6132006 209附 录 A (资料性附录) 柑桔黄龙病症状特征 A 症状特征 柑桔黄龙病不同时期不同部位的典型症状如下: 春梢 病树上当年抽生的春梢叶片转绿后,自5月开始其新梢成熟叶片一般沿主侧脉附近、叶片基部及边缘褪绿黄化,形成黄绿相间的斑驳症状。特点:春梢叶片转绿后才褪绿变黄;叶片黄化程度较轻且不均匀,形成斑驳;发病的新梢较多,在树冠的上、中、下部 均有出现;春梢病状发展较快,在4般到冬季便可全株发病。 夏秋梢 5梢一般出现在树冠顶部,多数1病的夏秋梢在。

    10、叶片老熟过程中往往叶脉先变黄,随后叶肉由淡黄绿变成黄色,均匀黄化,形成黄梢。 病梢中后期症状 当年感病的黄梢一般在秋末先后落叶成秃枝,翌年春季秃枝重新萌发新芽,且时间早萌芽多,所形成的新梢短而纤弱,叶片窄小,叶片老熟时,叶肉停止转绿变黄,但叶脉和其附近组织仍绿色,症状与缺锌、缺锰相似,形成花叶。 果实症状 感病中期病树所结果实,一般外形变小、畸形,坚硬,着色不均匀,果顶青色;果肉汁少、味酸、渣多,风味极差;种子变褐,发育不健全。 6132006 210 附 录 B (资料性附录) 柑桔木虱形态特征 类地位 柑桔木虱 态特征 成虫 卵近椭圆形,上端尖细,下端钝圆,形似杧果 。有一短柄、桔黄色,生或不规则聚生。 虫 身青灰色,有刻点,上有白蜡粉,头部灰褐色,头部前方的两个颊锥凸出明显。触角10节,灰黄色,端部2节黑色,末端具2根长短不一的硬毛。前胸略隆起。前翅半透明,散布褐色斑纹,前缘色深形成褐色带,近外缘的边上有5个半圆形透明斑。脉序“介”字形分枝,缺翅痣。后翅稍短无色透明。足黄色或黄褐色。腹背黑褐色,腹面淡绿色。雌虫产卵期呈桔红色。腹部纺锤形,末端尖。 虫 若虫扁椭圆形,背面隆起。共5龄,1龄黄色,复眼红色,自3龄起各龄后期体色变为黄、褐相间的颜色。二龄始显露翅芽。各龄若虫腹部周缘分泌有白色蜡丝,自头部至腹部第4节背中线为黄白色或黄绿色。 。

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