第一节抗原-抗体反应抗原和相应抗体在体内或体外相遇可

第一节 抗原－抗体反应 抗原与相应抗体在体内或体外相遇可发生 特异性结合，呈现的某种反应现象。 抗原抗体反应有以下几个特点: 1.抗原与抗体结合是特异性结合 表位(抗原)——超变区(抗体) 2.抗原抗体结合是分子表面的非共价键 结合 氢键、疏水键、静电引力和范德 华力(Van der waal‘s force) 、电子云力 的合力。 抗原和抗体可解离,性质不变。 3.抗原抗体反应可分为两个阶段 （1）特异性结合阶段  此阶段需时短,仅需几秒到几分钟,无 可见 反应出现 （2）可见反应阶段 需时较长,数分,数小时或数日出现可 见现 象,表现为沉淀,凝集,细胞溶解等 4.抗原和抗体结合是否呈现明显可见的反 应现 象,与两者的分子比例密切相关 抗原抗体反应的主要影响因素： 1.电解质: 在中性或碱性条件下,抗原抗体均带 负电荷,适当浓度的电解质会使它们失去一部 分负电荷而互相结合,出现明显的沉淀或凝集现 象。 2.温度: 37℃ 3. 酸碱度: pH6-8 抗原抗体反应包括： 沉淀反应 凝集反应 溶解反应 补体结合反应 中和反应 已知抗体 检测未知抗原； 已知抗原 检测未知抗体。 一、沉淀反应(precipitation) 概念：可溶性抗原与相应抗体在电 解质存在条件下结合，出现沉淀物的现象。 沉淀反应的试验方法：环状法 絮状法 琼脂中沉淀 法 环状法 —— 重层法 灵敏度：0.5ug抗体/ml 原理： 絮状法 —— 混合法 灵敏度：1.5ug抗体/ml 原理： 琼脂中沉淀反应法： n 双向免疫扩散(double immunodiffusion) n 单向免疫扩散(single radial immunodiffusio n) n 对流免疫电泳(counter immunoelectrophor esis) n 火箭电泳(rocket electrophoresis) n 免疫电泳(immunoelectrophoresis) (一)双向免疫扩散(double immu nodiffusion) 原理：在琼脂板上按一定距离打孔， 抗原和抗体分别加入相邻孔中，使其向孔周 围扩散，比例适宜相对应的抗原抗体结合， 在抗原抗体孔间出现白色的沉淀线(沉淀物) 。 灵敏度：1～20μg抗体/ml 应用： 主要用于检测体液中各种蛋白成 分，如甲胎蛋白（AFP）、乙型肝炎表面抗 原（HBsAg）等。 (二)单向免疫扩散(single radial im munodiffusion) 原理：抗体预先与琼脂混匀制成凝 胶板，打孔,将可溶性抗原加至孔中，向周 围扩散，与抗体在比例适宜处形成白色沉淀 环。沉淀环的直径与抗原浓度呈正相关。根 据沉淀环直径大小从预先绘制成的标准曲线 ，查出待测标本中抗原含量。 优点：定量测定抗原，方法简便， 易观察结果。 灵敏度：1～20μg／ml。 缺点：需时长，1～2天观察结果。 应用：常用于血清中IgG、IgM、IgA 和C3的定量检测。 (三)对流免疫电泳(counter immunoelec trophoresis) 原理：在电场中进行双向免疫扩散。 加抗原孔靠近阴极，加抗体孔靠近 阳极。通电(缓冲液pH 8.6)后，抗原向阳极泳 动，抗体向阴极泳动，二者在比例适宜处形成 白色沉淀线。 特点：出结果快于双向免疫扩散，约需1小 时； 灵敏度:10μg／ml。 (四)火箭电泳(rocket electrophoresis,又称电免疫扩散) 原理：在电场中进行单向免疫扩散 。 抗原在含抗体的琼脂中泳动，二者 于比例适宜处形成沉淀峰。沉淀峰的高度与 抗原含量成正比。从参考曲线查出抗原含量 。 敏感度： 1～20μg／ml 优点：需时较短。 应用：测定抗原含量。 (五)免疫电泳 (immunoelectrophoresis) 原理：将抗原在琼脂平板上进行电 泳，然后沿电泳方向挖一与抗原平行槽，加 入抗体，进行双向免疫扩散。抗原与抗体在 比例适宜处形成沉淀弧。根据沉淀弧的数量 、位置和形状，与已知标准抗原比较，即可 分析抗原的成分及性质。 应用：血清蛋白组分分析； 抗原成分分析。 二、凝集反应(agglutination) 概念：颗粒性抗原或吸附于颗粒上 的可溶性抗原(或抗体)于相应抗体(或抗原) ，在电解质存在下出现凝集物的现象。 凝集反应包括： ◆ 直接凝集反应 (direct agglutination) ◆ 间接(被动)凝集反应 (indirect/passive agglutination) ◆ 间接凝集抑制试验(indirect agglutination inhibition test) ◆ 协同凝集试验(coagglutination test) ◆ 抗球蛋白试验(antiglobulin test， Coomb’s test) (一)直接凝集反应(direct agglutination) 原理：颗粒性抗原(本身) + 抗体 凝集 包括： 玻片法：定性，用于：菌种鉴定 人ABO血型鉴定 试管法：半定量，用于：伤寒或副伤寒 诊断 肥达氏反应(Widal test), 布氏菌病诊断 瑞特氏反应 (Wright test) 直接凝集反应（玻片法）直接凝集反应（玻片法） (二)间接(被动)凝集反应 (indirect/passive agglutination) 原理： 可溶性抗原(或抗体)，吸附颗粒载体 ＋ 抗体(或抗原)  凝集 间接凝集反应种类及所用载体 间接凝集反应 载体 间接血凝实验 红细胞 间接乳胶凝集实验 聚苯乙烯胶乳颗 粒 间接炭凝实验 活性炭 (三)间接凝集抑制试验 (indirect agglu-tination inhibition test) 原理： 抗体 ＋ 反应 ＋ 抗原致敏载体 颗粒 可溶性抗原 凝集 (四)协同凝集试验(coagglutination test) 原理： IgG结合于SPA (金黄色葡萄球菌) ＋ 凝集 抗原(可溶性） 应用：检测微量抗原(存在于血液、脑脊 液和其他分泌液)。用于流脑、伤寒、布氏菌 病等的早期诊断。 (五)抗球蛋白试验(antiglobulin test， Coomb’s test) 原理： 红细胞(Rh+) ＋ 凝集(不可见) ＋ 抗人 球蛋 抗Rh抗体(IgG) 白抗体 凝集(可见) 灵敏度：3X10-2ug/ml 二种方法：A.直接抗球蛋白实验 B.间接抗球蛋白实验 三.免疫标记技术 用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体(或抗原)，与抗原(或抗体)进行反应 ，通过检测示踪物质，分析被检抗原(或抗体) 的存在或含量的方法。 灵敏度：高，1X10-4 ～1X10-5ug抗体 /ml 应用：微量物质的定性、定量或定位 。 免疫标记技术的基本类型： （一）免疫荧光技术 (immunofluorescence technique) （二）免疫酶技术(immunoenzymatic technique) （三）同位素标记技术(isotope labelling technique) （一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技 术) 原理：用荧光素(如异硫氰酸荧光素 、罗丹明B200等) 标记抗体(荧光抗体)，用荧 光抗体浸染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体 结合，于荧光显微镜下观察荧光，确定被检抗 原的存在。 免疫荧光技术包括： 直接法 间接法 间接补体增强 法 1．直接法 优点：特异性强 缺点：必须制备针对每一种抗原的荧 光抗体。 应用：用于抗原鉴定、定位和分布。 2．间接法 用荧光素标记抗球蛋白抗体( 荧光抗抗体) 优点：只制备一种荧素光标记的抗 体，可检测多种抗原或抗体 缺点：易产生非特异性荧光 应用： （1）检测抗原：如T细胞亚群检测 【抗体(第一抗体，已知) ＋ 抗原 】＋荧光抗抗体(第二抗体) 荧光显微镜 下观察荧光 （2）检测抗体：如抗核抗体检测 【抗原(已知)＋抗体(未知抗体)】 ＋荧光抗抗体(第二抗体) 荧光显微镜下 观察荧光 3．间接补体增强法 原理：{【抗体(或抗原，已知) ＋ 抗原 (或抗体，未知)】＋ 补体} ＋ 荧光标 记抗补体C3的抗体 显微镜下观察荧光 优点：敏感性高 缺点：易产生非特异性荧光 应用：检测抗原或抗体 （二）免疫酶技术(immunoenzymatic techniq ues) 是将抗原抗体反应与酶催化底物的 作用相结合的一种方法。 主要有两种类型： 1.免疫酶染色 2.酶免疫测定（enzyme immunoassay, EIA） 1.免疫酶染色(又称免疫组化技术, immunohistochemistry technique) 原理：用酶(如辣根过氧化物酶、碱性 磷酸酶等) 标记抗体(酶标抗体)，将酶标抗 体与抗原(细胞或组织切片)作用，抗原与酶 标记抗体结合，加底物，酶催化底物产生有 色物质，观察结果。 应用：细胞内、组织内抗原的定 性、定量和定位检测。 2.酶免疫测定 酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 原理：①将抗原(或抗体)结合于固相载 体； ②与抗体(或抗原)反应；③加酶底物，酶 促反 应。 灵敏度：2X10-5 20μg／ml 应用：广泛，可检测微量抗体和抗原( 如微生物成分、激素、细胞因子、粘附分子等 ）。 ELISA法： 直接法 间接法 双抗体夹心法(双位点法) 竞争法 (三) 同位素标记技术(isotope-labelling technique) 放射免疫分析 (radioimmunoassay, RIA) 是一种放射性同位素分析与抗原抗 体反应相结合方法。 优点：灵敏度高, 可检测0.001pg／ mL 特异性强 应用：微量抗原和抗体检测。 缺点：不稳定，废物处理麻烦等。 1.检测抗原 抗原竞争法 【Ab(有限量) + Ag(待测）】 + Ag*(已 定量) ↓ Ag-Ab复合物或Ag*-Ab ↓ 分离Ag*-Ab和游离Ag* ↓ 测定Ag*-Ab和游离Ag*放射性 ↓ 从标准曲线上读知含量 2.检测抗体 放射过敏原吸附试验 (radioallergosorbent test ,RAST) 原理：与ELISA间接法相同。 应用：可用于病人血清中过敏原特异 性 IgE抗体的定性或定量检测。 （四）发光免疫分析(luminescent immuno -assay, LIA) 原理：用发光物质标记抗体(或抗原), 再同抗原(或抗体)进行反应，以发光现象作为 抗原抗体反应的指示系统。 应用：定量检测抗原、抗体。 发光分为：化学发光 (chemiluminescence) 生物发光（ bioluminescence） 化学发光原理： 发光物质 激发态分子 基态 分子 释放光子( 发光) 化学发光剂：鲁米诺（luminol ） 反应剂：过氧化阴离子 反应剂反应剂 （五）免疫胶体金技术(colloidal gold ／immunogold staining) 原理：胶体金标记蛋白质(如抗体) + 组织细胞(待测) 观察结果(用电镜、 光镜或肉眼) 应用：免疫组织化学定位，测定细 胞表面标志和细胞内成分。 优点：易行、省时、价廉、灵敏度 高。 胶体金：用还原法将四氯金酸 (HAuCl4)制成特定大小的金颗粒，该颗粒由 于静电作用呈稳定的胶体状态，称为胶体金 。